在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，支原體感染發(fā)生率達(dá)到63%，因而細(xì)胞培養(yǎng)過程中被支原體污染是一個世界性的難題。細(xì)胞培養(yǎng)中常遇見的有細(xì)菌污染、真菌污染、支原體污染、病毒污染等。說起支原體污染，估計細(xì)胞培養(yǎng)的同學(xué)就開始犯愁了，細(xì)胞培養(yǎng)的老手都知道，支原體污染非常不易察覺。有的實驗室被支原體污染后，如果不進(jìn)行有效*的支原體清除，該實驗的細(xì)胞培養(yǎng)很難進(jìn)行下去，細(xì)胞傳代3代以后狀態(tài)就急劇下滑，無法進(jìn)行正常實驗，有的實驗室甚至只能指望換細(xì)胞間。那么怎樣才能有效檢測并清除支原體污染呢?

支原體污染的來源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)的污染、污染支原體的細(xì)胞造成的交叉污染、實驗器材帶來的污染和用來制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染。細(xì)胞培養(yǎng)工作中，主要從以下幾個方面來預(yù)防支原體的污染：控制環(huán)境污染；嚴(yán)格實驗操作；細(xì)胞培養(yǎng)和器材要保證無菌；在細(xì)胞培養(yǎng)中加入適量的抗生素。

據(jù)了解，抗生素不能*根zhi支原體感染，停藥后一段時間可以復(fù)發(fā)。因此，本文著重講述細(xì)胞支原體污染預(yù)防之支原體快速檢測和環(huán)境空間消毒方案，從根本入手預(yù)防解決細(xì)胞培養(yǎng)支原體污染問題。

1、支原體檢測

市場上支原體檢測方案琳瑯滿目，我們在做細(xì)胞培養(yǎng)時肯定不想在支原體檢測上花費一天的時間，哪種方案最為快速有效？在這兒介紹一種可以在30分鐘內(nèi)完成支原體檢測的試劑盒，該試劑盒是由我國蘇州先達(dá)基因公司研發(fā)的，其原理是基于公司自主開發(fā)的實時熒光恒溫核酸檢測技術(shù)（ERA），可以在恒定的低溫下（25℃-42℃）對痕量的支原體種內(nèi)保守性DNA片段進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)可以在20min內(nèi)完成，該試劑盒檢測范圍涵蓋130種支原體。

ERA核酸擴(kuò)增技術(shù)的核心是一套等溫核酸擴(kuò)增組合酶制劑。通過酶工程改造，將來源于細(xì)菌和病毒的特定工具酶進(jìn)行改造突變并篩選其功能，通過不同的DNA擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化組合，從而獲得8種酶蛋白為核心的等溫擴(kuò)增體系。配好的反應(yīng)體系在各種實時熒光定量儀或者先達(dá)基因自主研發(fā)的簡易恒溫?zé)晒鈾z測儀中，可實現(xiàn)恒溫擴(kuò)增與熒光信號檢測于一體，通過實時熒光擴(kuò)增曲線在20min內(nèi)就可通過檢測儀的顯示屏讀出檢測結(jié)果，檢測過程無需開蓋，避免氣溶膠的產(chǎn)生，結(jié)果可靠性大幅度提高。ERA結(jié)合先達(dá)基因提供的一步法提取DNA的試劑，進(jìn)一步簡化了支原體檢測操作，5min完成細(xì)胞液的DNA提取，20min完成支原體DNA分子檢測，整個過程只需30min。

2、環(huán)境空間消毒方案

環(huán)境空間消毒包括：環(huán)境空氣消毒、物體表面消毒、生物安全柜或超凈工作臺滅菌及培養(yǎng)箱消毒。目前大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)室只是簡單安裝了臭氧消毒機，而從建立使用到后期從來沒有經(jīng)過大消毒（熏蒸滅菌），這給細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境微生物污染帶來了極大的隱患和風(fēng)險，因為臭氧消毒能力有限不穩(wěn)定而且不能全面覆蓋，無法殺滅微生物休眠體，單純的臭氧消毒已不能深入的解決環(huán)境微生物問題，只能說是一種微生物水平控制的輔助手段。根據(jù)美國FDA、新版GMP及相關(guān)國際組織，現(xiàn)行的主流無菌室環(huán)境空間消毒是H2O2氣體滅菌，環(huán)保無毒無殘留，安全又快速。H2O2氣體滅菌應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)室消毒代替甲醛熏蒸將成為未來趨勢。

H2O2干霧氣體能快速殺滅細(xì)菌、真菌、支原體及病毒，法國歐菲姆H2O2干霧滅菌新技術(shù)應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)室環(huán)境消毒則更具創(chuàng)新性和實用適用價值。

環(huán)境及人員操作污染風(fēng)險大，干霧滅菌方法能把這種污染風(fēng)險降至低，其靈活消毒的特點更能為微生物防控提供有力支撐，細(xì)胞房環(huán)境、培養(yǎng)箱等均可輕松進(jìn)行滅菌處理而無需再投入過多的人力和物力，平常消毒及應(yīng)急消毒可謂獨yi無二。

法國歐菲姆H2O2干霧滅菌器源于歐盟GMP設(shè)計，自身符合潔凈區(qū)凈化要求，不帶入任何外源污染的同時高效治療潔凈室空間微生物，達(dá)到無菌凈化的目標(biāo)。采用了先進(jìn)的霧化技術(shù)，霧化顆粒小于3微米，增效了空間擴(kuò)散均勻性，迅速彌漫充滿整個密閉空間不放過每一處死角，滅菌效果堪稱空qian絕hou，其均勻性、無殘留及對機器無傷害特征非常吻合細(xì)胞房環(huán)境消毒及培養(yǎng)箱里面消毒。

歐菲姆干霧H2O2滅菌器源于歐洲法國，專門針對潔凈廠房無菌室GMP設(shè)計，適應(yīng)大空間滅菌，小空間滅菌更靈活。采用了先進(jìn)霧化技術(shù)，霧化粒徑平均達(dá)到3—5微米，配合空間殺孢子劑使用，滅菌效果能對嗜熱脂肪桿菌芽孢降低6個對數(shù)值。

歐菲姆原理：歐菲姆采用獨到而特殊的結(jié)構(gòu)設(shè)計，使得在僅僅輸入電能的情況下，集壓縮、ventur噴射和霧滴內(nèi)外部濺射碎化功能于一體，使專用液態(tài)殺孢子劑變成氣霧狀態(tài)極微小顆粒噴出，高速極小微粒與空氣接觸后充分氣化，變成氣態(tài)H2O2即為“干霧"。

深圳潤聯(lián)利用歐菲姆H2O2干霧滅菌器，針對不同行業(yè)的實驗室以及醫(yī)療機構(gòu)，會提出不同環(huán)境消毒控制經(jīng)驗，無論是P3實驗室，無菌制劑生產(chǎn)車間，SFP動物實驗室，深圳潤聯(lián)均有針對所在行業(yè)的具體空間消毒方案。

德國MB生產(chǎn)的Mycoplasma-offTM噴霧劑，或濕巾擦拭 5-10分鐘清除，對支原體、細(xì)菌、真菌、霉菌、孢子祛除確切有效。無殘留, 無腐蝕, 無致癌性，操作簡單方便。

qPCR法介紹：

熒光定量PCR法（qPCR）：是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，將『針對支原體特異性保守序列的探針』做熒光標(biāo)記，使PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物帶有熒光，利用熒光信號的變化和配套軟件，進(jìn)行DNA擴(kuò)增反應(yīng)的實時監(jiān)測，簡稱qPCR。

優(yōu)點：①靈敏度高、特異性強。

②時間短，2-3小時出結(jié)果。

③檢測結(jié)果可定量。

④操作簡便。

缺點：①對于已做支原體滅活處理的樣品，由于支原體DNA仍舊存在其中，PCR結(jié)果會出現(xiàn)假陽性。（可用培養(yǎng)法做補充驗證）

②不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大（由于引物及內(nèi)在設(shè)計不同），需謹(jǐn)慎選擇，盡量在專業(yè)人員推薦指導(dǎo)下使用。